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奶酪的成熟涉及多種生化變化，例如脂肪水解、乳糖發(fā)酵和蛋白質(zhì)降解。這些過(guò)程極大地影響了奶酪的質(zhì)地、味道和香氣。更具體地說(shuō)，氨基酸的含量和特性會(huì)影響整個(gè)老化過(guò)程的奶酪風(fēng)味。食物中的氨基酸既是游離的未結(jié)合分子，也是通過(guò)肽鍵結(jié)合在一起的氨基酸殘基，從而產(chǎn)生乳制品中存在的各種蛋白質(zhì)。為了全面評(píng)估奶酪在整個(gè)成熟過(guò)程中的氨基酸含量，需要對(duì)氨基酸組成進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估。為此，必須水解蛋白質(zhì)，有效地釋放氨基酸殘基，然后可以在水解產(chǎn)物中對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)。

傳統(tǒng)上，蛋白質(zhì)在酸性或堿性條件下分別用 6 N HCl 或 4 N NaOH 在密封容器中 110 °C 處理18至24小時(shí)進(jìn)行化學(xué)水解，時(shí)間、溫度和試劑等因素會(huì)影響水解反應(yīng)的準(zhǔn)確性和精密度，從而影響氨基酸定量。總之，氨基酸分析是一項(xiàng)昂貴、棘手且耗時(shí)的實(shí)驗(yàn)室程序。通常，水解反應(yīng)代表著這個(gè)過(guò)程的反應(yīng)速度受到限制；減少有機(jī)反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間，另一種方法是用微波能代替常規(guī)加熱。與傳統(tǒng)的加熱方法相比，微波可以在更高的溫度和更短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)成功地促進(jìn)蛋白質(zhì)水解反應(yīng)。CEM 的 Discover® 2.0 微 波反應(yīng)器可以為實(shí)驗(yàn)室提供工具，以高效、可重復(fù)和安全的方式。

材料與方法

試劑與樣品

所有試劑均購(gòu)自商業(yè)供應(yīng)商，水解溶液在使用前新鮮制備。從當(dāng)?shù)氐纳痰晔占汤覙悠罚谑称芳庸C(jī)中均質(zhì)化，并在 4°C 下儲(chǔ)存直至分析。使用分析天平等分每個(gè)樣品的 300mg 部分，用于其扌旨定的水解反應(yīng)。水解產(chǎn)物的氨基酸含量通過(guò)柱前衍生化，然后進(jìn)行 UPLC 進(jìn)樣和 260nm處的 PDA 檢測(cè)來(lái)確定。Waters AccQ-Tag™ Ultra Derivatization 試劑盒用于水解產(chǎn)物的 LC- PDA 分析。所有樣品一式三份進(jìn)行分析。

傳統(tǒng)的氨基酸水解方法

在玻璃小瓶中加入 300mg 樣品，然后加入 2.5mL 含 3% (w/v) 苯酚溶液的 6 N HCl。然后用 N 2 吹掃反應(yīng)瓶并迅速密封。重復(fù)此過(guò)程，直到所有樣品都準(zhǔn)備好放入 110°C 烘箱中20小時(shí)。完成后，將樣品從烘箱中取出并在衍生前冷卻至室溫。

Discover 2.0 水解方法

反應(yīng)設(shè)置：將 300mg 樣品部分添加到配備有攪拌棒的 35-mL Pyrex 容器中。然后向每個(gè)微波反應(yīng)容器中加入體積為 5mL 的 6 N HCl w/3% 苯酚。

容器用 N2 吹掃5分鐘，用 Teflon® 內(nèi)襯硅膠蓋快速密封，然后放置在自動(dòng)進(jìn)樣器架中，以便自動(dòng)放置在 Discover 2.0 腔中。 

方法編程：一步動(dòng)態(tài)法，在 Discover2.0 系統(tǒng)中為奶酪的氨基酸水解編程。 

使用以下的方法參數(shù)： 

酸水解

容器類(lèi)型：Pyrex

控制方式: Dynamic動(dòng)態(tài) 

溫度: 165 °C 

時(shí)間：20-min

壓力: 300 PSI 

功率: 300 W 

攪拌: 高

分析樣品準(zhǔn)備

所有水解產(chǎn)物溶液通過(guò) 0.2µm PTFE 過(guò)濾器并用 6 M NaOH 中和，為 AccQ-Tag 衍生化做準(zhǔn)備。將來(lái)自 Waters AccQ-Tag Ultra Derivatization 試劑盒的 70µL 硼酸鹽緩沖液添加到新的回收瓶中。加入 10µL 中和樣品，將小瓶蓋上蓋子并渦旋。然后，將 20µL 從 試劑盒中制備的衍生化試劑添加到每個(gè)樣品反應(yīng)中。將反應(yīng)混合物渦旋10秒，然后在 55 °C 下加熱10分鐘，然后進(jìn)行分析。

分析

將 5µL 體積的每個(gè)衍生反應(yīng)注入與 Waters PDA 檢測(cè) 器相連的Waters Acquity H-Class UPLC。使用 Waters AccQ-Tag Ultra C18 色譜柱（1.7µm，2.1 x 100mm）以 0.25mL/min 的流速進(jìn)行分離。柱溫為 45°C。洗脫梯度如表1所示。流動(dòng)相為A：在 MilliQ 水中稀釋10倍的 Waters AccQ-Tag Eluent A 和 B：Waters AccQ-Tag Eluent B。為了確定每種氨基酸的氨基酸濃度，Waters Amino 酸標(biāo)準(zhǔn)（沃特世公司，部件號(hào) WAT088122）是在 5、10、25、50 和 100pmol/µL 的濃度下衍生。

參考文獻(xiàn)

AccQ-Tag™ is a trademark of Waters Corporation. Teflon®isa registered trademark and a brand name owned by Chemours (formally DuPont). 

Chen, S. T.; Chiou, S. H.; Chu, Y. H.; Wang, K. T. Int. J. Pept. Protein Res. 1987, 30, 572-576. 

Davidson, I. Methods Mol. Biol. 2003, 211, 111-22. 

Han, K.; Richard, C.; Biserte, G. Int. J. Biol. Chem. 1983, 15, 875-884. 

Margolis, S. A.; Jassie, L.; Kingston, H. M. J. Automat. Chem. 1991, 13, 93-95.